Vi siete mai sentiti confusi dai termini "PCR", "RT-PCR" e "qPCR" nel laboratorio?aiutarti a navigare nella tua ricerca in modo più efficace.
PCR: il "fotocopiatore" del DNA
Questa tecnica fondamentale di biologia molecolare, inventata da Kary Mullis, amplifica rapidamente le sequenze di DNA in vitro,che produce milioni o miliardi di copie in poche oreLa PCR è essenziale per la clonazione genica, il sequenziamento del DNA, la diagnosi delle malattie e numerose altre applicazioni.
Il processo di PCR consiste in tre fasi ripetute che consentono l'amplificazione esponenziale del DNA:
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Denaturazione:L'elevata temperatura (94-98°C) separa il DNA a doppio filamento in singoli filamenti.
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Annellazione:La riduzione della temperatura (50-65°C) consente ai primer di legarsi a sequenze bersaglio complementari.
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Estensione:La DNA polimerasi (tipicamente Taq polimerasi) sintetizza nuovi fili complementari a 72°C.
Dopo 25-40 cicli, il DNA amplificato può essere visualizzato utilizzando l'elettroforesi in gel di agarosio.
qPCR: la "fotocopiatrice" di monitoraggio in tempo reale
La PCR quantitativa (qPCR) o PCR in tempo reale si basa sulla PCR convenzionale incorporando il rilevamento della fluorescenza per monitorare l'amplificazione in tempo reale, quantificando la quantità iniziale del modello di DNA.
Esistono due metodi primari di rilevazione della fluorescenza:
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Tintori leganti il DNA (ad esempio, verde SYBR):E' conveniente, ma non specifico, lega tutto il DNA a doppio filamento.
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Sonde fluorescenti:Specifico per il bersaglio, ma piu' costoso, richiede sonde progettate su misura.
La metrica chiave del qPCR è il valore Ct (ciclo di soglia) il numero di cicli quando la fluorescenza supera una soglia definita.
Le applicazioni comprendono:
- Analisi dell'espressione genica
- Determinazione dell'agente patogeno
- Controlli antidroga
- Ricerca sul cancro
RT-PCR: L'RNA "Fotocopiatrice"
La PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) converte prima l'RNA in DNA complementare (cDNA) utilizzando la trascrittasi inversa, quindi amplifica il cDNA tramite PCR standard. Ciò consente l'analisi dell'RNA, tra cui:
- Studi sull'espressione genica
- rilevazione di virus RNA (ad esempio, HIV, influenza)
- Ricerca sulla struttura/funzione dell'RNA
RT-qPCR: Il sistema di quantificazione dell'RNA
La RT-PCR quantitativa in tempo reale combina la trascrizione inversa con la qPCR per quantificare i livelli di espressione dell'RNA.
- Misurazione precisa dell'espressione genica
- quantificazione del microRNA
- Studi lunghi di RNA non codificante
Analisi comparativa
| Caratteristica |
PCR |
qPCR |
RT-PCR |
RT-qPCR |
|
Modello
|
DNA |
DNA |
RNA |
RNA |
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Scopo
|
Amplificazione del DNA |
Quantificazione del DNA |
RNA→cDNA→DNA |
Quantificazione dell'RNA |
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Rilevazione
|
Elettroforesi in gel |
Fluorescenza |
Elettroforesi in gel |
Fluorescenza |
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Quantitativo
|
- No, no. |
- Sì, sì. |
- No, no. |
- Sì, sì. |
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Principali applicazioni
|
Clonazione, sequenziamento |
Analisi dell'espressione, diagnostica |
Rilevazione di virus RNA |
Studi sull'espressione genica |
Considerazioni tecniche
Progettazione del primer/sonda
La qPCR richiede dei primer e delle sonde attentamente progettati per garantire la specificità.
Selezione della trascrittasi inversa
Diversi enzimi (ad esempio, AMV, M-MLV) variano nella stabilità termica e nell'efficienza, influenzando il rendimento del cDNA.
Evitare gli artefatti
L'amplificazione non specifica può essere ridotta al minimo attraverso temperature di ricottura ottimizzate e polimerasi ad alta fedeltà.
La comprensione delle differenze di queste tecniche molecolari consente ai ricercatori di selezionare metodi appropriati per le loro esigenze sperimentali specifiche, garantendo risultati accurati e affidabili.
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