Interpretazione dei principi dei test RTPCR e rischio COVID19

Poiché la pandemia di COVID-19 continua a presentare sfide globali, i test RT-PCR (reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa) rimangono il gold standard per la diagnosi dell’infezione da SARS-CoV-2. Ma quanti comprendono veramente i principi scientifici alla base di questo strumento diagnostico cruciale? Questo articolo fornisce una spiegazione approfondita ma accessibile dei test RT-PCR, aiutando sia i professionisti medici che il pubblico in generale a comprendere meglio questa tecnologia vitale.

La RT-PCR, o reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa in tempo reale, è una tecnica di biologia molecolare rapida e altamente sensibile utilizzata per rilevare materiale genetico specifico nei campioni. Questo materiale genetico può provenire da esseri umani, batteri o virus come SARS-CoV-2.

La tecnologia principale alla base della RT-PCR è la PCR, inventata da Kary B. Mullis negli anni '80 (che gli è valsa un premio Nobel). La PCR amplifica e rileva specifici target del DNA. Miglioramenti successivi hanno consentito la visualizzazione e la quantificazione "in tempo reale" dei target del DNA durante l'amplificazione. Nella PCR in tempo reale, l'intensità della fluorescenza proveniente da sonde specializzate è correlata alla quantità di DNA amplificato.

Tuttavia, la PCR standard rileva solo il DNA. Poiché SARS-CoV-2 contiene materiale genetico RNA, il test richiede l’enzima trascrittasi inversa per convertire l’RNA in DNA complementare (cDNA). Questa fase di trascrizione inversa, combinata con la PCR in tempo reale, rende la RT-PCR un potente strumento per rilevare virus a RNA come SARS-CoV-2.

Comprendere la RT-PCR richiede una conoscenza di base del materiale genetico, il manuale di istruzioni che governa il comportamento, la sopravvivenza e la riproduzione cellulare e virale. Il materiale genetico è disponibile in due forme primarie: DNA (acido desossiribonucleico) e RNA (acido ribonucleico). Il DNA presenta una struttura a doppio filamento mentre l'RNA è a filamento singolo. Per scopi diagnostici, la maggiore stabilità del DNA lo rende preferibile per i test sulle malattie infettive. In particolare, SARS-CoV-2 contiene solo RNA.

Tutti i virus condividono la caratteristica di dipendere dalle cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione. SARS-CoV-2, come altri virus, invade le cellule sane per riprodursi. Quando si verifica l’infezione, il virus rilascia il suo RNA e dirotta il macchinario cellulare per replicarsi. Finché il materiale genetico virale rimane nelle cellule, la RT-PCR può rilevare l’infezione da SARS-CoV-2.

Gli operatori sanitari addestrati raccolgono campioni di tamponi nasofaringei, che vengono poi inseriti in provette sterili contenenti un mezzo di trasporto virale per preservare l'integrità virale.

In laboratorio, i ricercatori estraggono l’RNA utilizzando kit di purificazione commerciali. Il campione di RNA viene quindi aggiunto a una miscela di reazione contenente tutti i componenti necessari per il test, tra cui DNA polimerasi, trascrittasi inversa, elementi costitutivi del DNA e sonde fluorescenti e primer specifici per SARS-CoV-2.

Poiché la PCR funziona solo con modelli di DNA, la trascrittasi inversa converte tutto l’RNA nel campione (incluso l’RNA umano, batterico, di altri coronavirus e potenzialmente l’RNA di SARS-CoV-2) in cDNA.

Questo processo prevede tre passaggi ripetitivi:

• Denaturazione:Il riscaldamento del DNA a >90°C per circa 10 minuti separa il DNA a doppio filamento in filamenti singoli.
• Ricottura del primer:Frammenti di DNA corti appositamente progettati (primer) si attaccano a target specifici del cDNA di SARS-CoV-2 a temperature più basse. I bersagli comuni del gene COVID-19 includono la RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRP), ORF1ab, il gene S (proteina spike), il gene N (nucleocapsid) e il gene E (involucro).
• Estensione:La DNA polimerasi utilizza i primer come punto di partenza per creare copie identiche dei segmenti di DNA bersaglio.

Il processo si ripete tipicamente 40 volte, raddoppiando il DNA bersaglio ad ogni ciclo. Le sonde fluorescenti si legano a valle dei primer, rilasciando segnali rilevabili ad ogni amplificazione del DNA. L’aumento del DNA target è correlato all’aumento dell’intensità della fluorescenza.

I dati di fluorescenza generano un valore di "Soglia di ciclo" (Ct), il numero di cicli necessari affinché il segnale superi i livelli di fondo. I campioni con più DNA target si amplificano più velocemente, richiedendo meno cicli (valori Ct più bassi). Al contrario, un DNA bersaglio scarso richiede più cicli (valori Ct più alti).

I valori Ct forniscono informazioni cruciali sulla carica virale. Valori Ct più bassi indicano quantità più elevate del genoma virale, mentre valori più alti suggeriscono quantità inferiori. Gli operatori sanitari combinano i valori Ct con i sintomi clinici e l’anamnesi per valutare lo stadio della malattia. I valori Ct seriali derivanti da test ripetuti aiutano a monitorare la progressione della malattia e a prevedere il recupero. I traccianti di contatto utilizzano anche i valori Ct per dare priorità ai pazienti con la carica virale più elevata (e quindi con il maggior rischio di trasmissione).

• Carica virale:I valori Ct sono inversamente correlati alla carica virale: un Ct più basso significa una maggiore presenza di virus.
• Stadio della malattia:L'infezione precoce mostra tipicamente cariche virali elevate (Ct basso), mentre le fasi successive mostrano cariche in calo (Ct in aumento) man mano che il sistema immunitario elimina l'infezione.
• Rischio di trasmissione:Cariche virali più elevate (valori Ct più bassi) indicano un maggiore potenziale di trasmissione, garantendo misure di isolamento più rigorose.

Nonostante sia il gold standard diagnostico del COVID-19, la RT-PCR presenta dei limiti:

• Falsi negativi:Un campionamento improprio, una bassa carica virale o test precoci possono produrre risultati negativi nonostante l’effettiva infezione.
• Falsi positivi:Risultati positivi rari ma possibili senza infezione reale.
• Sfide di standardizzazione:Diversi laboratori e piattaforme possono utilizzare soglie Ct diverse, complicando i confronti.

I test RT-PCR rimangono essenziali per la diagnosi di COVID-19 rilevando il materiale genetico SARS-CoV-2. I valori Ct fungono da indicatori vitali della carica virale, della progressione della malattia e del rischio di trasmissione. Tuttavia, le limitazioni dei test richiedono la combinazione dei risultati con la valutazione clinica per una diagnosi e una gestione accurate.