Blog circa Principi fondamentali e risoluzione dei problemi per i kit di estrazione degli acidi nucleici

L'estrazione dell'acido nucleico è la pietra angolare degli esperimenti di biologia molecolare.molti ricercatori si trovano perplessi, in particolare quando si tratta di risolvere problemi con risultati inaspettati. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, un processo efficiente.

La maggior parte dei kit di estrazione degli acidi nucleici commerciali utilizza la tecnologia della spin colonna della membrana di silice, con cinque fasi critiche: lisi cellulare, legame degli acidi nucleici, lavaggio e depurazione, asciugatura,e eluzione finaleOgni passo si basa su quello precedente, il che significa che ogni passo sbagliato può compromettere l'intera estrazione.

L'effettiva lisi cellulare rappresenta il primo passo cruciale.ma in genere contengono elevate concentrazioni di sali caotropici che servono a duplice scopo:

• Denaturazione delle proteine:Questi sali interrompono i legami idrogeno, le forze di van der Waals e le interazioni idrofobe, destabilizzando le proteine (comprese le nucleasi) per prevenire la degradazione degli acidi nucleici.
• Facilitare il legame della silice:I caotropi spostano le molecole d'acqua dagli acidi nucleici, creando condizioni ottimali per il trasferimento sulle membrane di silice.

I sali caotropici più comuni sono il cloridruro di guanidina, il tiocyanato di guanidina, l'urea e il percloro di litio.A seconda del tipo di campioneLa proteasi K digerisce efficacemente le proteine in preparazioni di acidi nucleici, in particolare in condizioni di denaturazione.anche se la sua attività diminuisce in condizioni di denaturazione.

L'estrazione del plasmido differisce significativamente dall'isolamento dell'RNA o del DNA genomico.Aggiungere immediatamente i sali caotropici libererebbe indiscriminatamente tutti i tipi di DNAPertanto, i protocolli dei plasmidi introducono tipicamente caotropi dopo la lisi cellulare iniziale.

Oltre alla lisi, i sali caotropici facilitano il legame degli acidi nucleici con le colonne di silice.Le colonne di silice contengono resina che si lega selettivamente al DNA o all'RNA a seconda della concentrazione di sale e di altri fattoriGli acidi nucleici ottenuti presentano elevata purezza e sono adatti alla clonazione, al sequenziamento a lunghe letture e ad altre applicazioni.

L'eccesso di etanolo precipita materiale degradato e piccole molecole, influenzando le letture di assorbimento A260.L'etanolo insufficiente può ostacolare l'eliminazione del sale dalle membraneI volumi di etanolo forniti dal kit sono pre-ottimizzati, ma se il DNA degradato sembra distorcere le letture di A260, la ri-ottimizzazione della concentrazione di etanolo può aiutare.Le soluzioni di flusso possono essere salvate per la precipitazione per recuperare gli acidi nucleici persiQuando i detersivi contenenti SDS vengono utilizzati nella lisi, il NaCl funge da precipitante efficace che evita la contaminazione del detersivo.

Dopo aver centrifugato il lisato attraverso le membrane di silice, gli acidi nucleici bersaglio si legano alle colonne mentre le proteine e i polisaccaridi rimangono in flusso.le membrane conservano proteine e sali residuiI campioni di piante possono lasciare polisaccaridi e pigmenti; i campioni di sangue spesso producono una decolorazione marrone o gialla.

Due lavaggi sono tipici, anche se il numero esatto dipende dal tipo di campione.seguito da lavaggi con etanolo per eliminare i saliI campioni inizialmente a basso contenuto di proteine (ad esempio, preparazioni di plasmidi o purificazione del prodotto PCR) possono richiedere solo lavaggio con etanolo.Alcuni kit raccomandano il doppio lavaggio con etanoloI sali residui inibiscono l'eluzione, riducendo le rese e aumentando le letture di A230, che abbassano i rapporti A260/230.

La maggior parte dei protocolli prevede la centrifugazione post-lavaggio per asciugare l'etanolo residuo dalle colonne.Aggiungere 10 mM di Tris tampone o acqua quindi reidrata gli acidi nucleici per il rilascio della membranaL'etanolo residuo impedisce la completa reidratazione ed eluzione, mentre l'etanolo non e' rilevabile con la spettrophotometria.segni rivelatori includono il mancato assestamento dei campioni nei pozzi di gel di agarosio (anche con il colorante di carico presente) o l'incapacità di congelarsi a -20°C.

L'ultima fase di estrazione del DNA rilascia acidi nucleici puri dalla silice.Il DNA rimane più stabile in pH debolmente alcalino e si dissolve più velocemente nel tampone che nell'acquaAnche i precipitati di DNA si comportano in modo simile. L'acqua presenta in genere un pH più basso (4-5), e il DNA ad alto peso molecolare potrebbe non reidratarsi completamente rapidamente.lasciare che il tampone si posizioni sulle membrane per diversi minuti prima della centrifugazionePer le applicazioni che richiedono un DNA di peso molecolare elevato intatto (ad esempio, sequenziamento a lunga lettura), i tamponi di eluzione sono ottimali.rendendo l'acqua il diluente preferito.

Anche seguendo i protocolli standard, le estrazioni possono incontrare vari problemi:

• Basso rendimento:Utilizzare sempre etanolo anidro fresco di alta qualità per la diluizione del tampone e le fasi di legame.L'etanolo di scarsa qualità o vecchio può assorbire l'umiditàRicordate che i tamponi di lavaggio non adeguatamente preparati possono strappare via gli acidi nucleici estratti!
• Purezza bassa:La contaminazione proteica è spesso causata da un materiale di partenza eccessivo che aumenta il rischio di dissoluzione incompleta.Utilizzare etanolo di altissima qualità per i tamponi di lavaggio, e se i problemi persistono, aggiungere ulteriori passaggi di lavaggio.
• Contaminanti:I campioni ambientali si dimostrano particolarmente sensibili alle sostanze umide che si co-purificano con il DNA e resistono alla rimozione della colonna di silice.Le tecniche specializzate consentono di rimuovere le proteine e gli umicidi che interferiscono prima del legame della colonna.
• Degradazione:L'RNA è soggetto a maggiori rischi di degradazione, in genere a causa di uno stoccaggio improprio del campione o di una lisi inefficiente (supponendo che venga utilizzata acqua priva di RNasi).la degradazione è meno importante per le applicazioni PCR, ma diventa critica per il sequenziamento a lunga lettura che richiede DNA di peso molecolare elevato intatto !
• Purificazione del prodotto PCR:In genere, 3-5 volumi di soluzione di sale vengono aggiunti per volume di reazione PCR prima della purificazione della colonna di spin.Le depurazioni fallite derivano solitamente da PCR fallite, ma risparmiare il flusso è saggio se le bande PCR trasparenti non legano le colonne, probabilmente rimarranno in flusso per il recupero e la ripurificazione.

La lisi incompleta può manifestarsi come rendimenti inaspettatamente bassi, dissoluzione incompleta delle proteine o rapporti A260/230 scarsi.Questi suggeriscono che alcuni componenti del campione non sono riusciti a lisare completamente o a dissolversi durante l'estrazione.La distinzione tra lisi incompleta e contaminazione o degradazione richiede un'attenta analisi delle condizioni di estrazione, compresa la composizione del tampone di lisi, i parametri di incubazione,e potenziali sostanze interferentiAd esempio, i rapporti A260/230 scarsi possono indicare sali residui dopo il legame o lavaggio insufficiente piuttosto che lisi incompleta.Per affrontare la lisi incompleta può essere necessario ottimizzare i componenti del buffer di lisi, tempi di incubazione o incorporando ulteriori metodi di lisi meccanica/enzimatica.

Le tecniche specializzate mirano alla rimozione di sostanze umiche e di altri interferenti che possono co-purificare con acidi nucleici dai campioni ambientali.Questi includono tamponi di estrazione specializzati contenenti agenti chelanti (e.g., EDTA) per legarsi e rimuovere i cationi in modo selettivo.Metodi di pretrattamento come la centrifugazione differenziale o la filtrazione possono aiutare a rimuovere particolato più grande dai campioni ambientali prima dell'estrazione dell'acido nucleico, riducendo le interferenze durante le fasi di legame.

Alcuni campioni (ad esempio tessuti o materiali ricchi di lipidi) presentano sfide specifiche.I campioni di tessuto richiedono spesso un'ulteriore interruzione meccanica o una digestione enzimatica per garantire una completa lisi e il rilascio di acidi nucleiciI campioni ricchi di lipidi possono complicare la purificazione in quanto i lipidi possono interferire con il legame degli acidi nucleici alle matrici di colonna.ottimizzazione dei protocolli di depurazione, o utilizzando kit appositamente progettati.

Pubblicato originariamente il 28 giugno 2010, rivisto e ripubblicato maggio 2021 e marzo 2024.